Изучение наследственных заболеваний – одна из старейших задач медицины. Ещё Гиппократ отмечал, что некоторые недуги «передаются в семьях». С тех пор учёные неуклонно совершенствуют методы выявления биологических корней этих наследственных закономерностей, глубоко проникая в человеческий геном.
Теперь команда исследователей из Европейской молекулярно-биологической лаборатории (EMBL) и их коллеги представили инструмент, который выводит одноклеточный анализ на принципиально новый уровень. Технология SDR-seq позволяет одновременно фиксировать как геномные вариации, так и РНК в одной и той же клетке. Это обеспечивает беспрецедентную точность и масштабируемость по сравнению с существующими методами. Новый подход даёт возможность учёным выявлять вариации в некодирующих областях ДНК – участках, которые чаще всего связаны с развитием болезней. Таким образом, открывается новый путь к исследованию того, как генетические различия влияют на здоровье человека и приводят к конкретным заболеваниям.
Доминик Линденхофер, ведущий автор статьи о SDR-seq, опубликованной в журнале Nature Methods, и постдокторант группы Штайнмеца в EMBL, поясняет, что ранее одновременный анализ ДНК и РНК в одной клетке сталкивался с ограничениями по пропускной способности, чувствительности и сложности. Существующие методы позволяли считывать варианты в тысячах клеток, но только при условии их экспрессии, то есть из кодирующих областей. SDR-seq работает независимо от расположения вариантов, позволяя анализировать обширные и сложные клеточные образцы.
ДНК человека состоит из кодирующих и некодирующих участков. Кодирующие сегменты служат «инструкциями» для создания белков, необходимых для жизнедеятельности организма, путём экспрессии в РНК. Однако некодирующие области, составляющие большую часть генома, содержат регуляторные элементы, которые контролируют рост и функционирование клеток. Более 95% ДНК-вариантов, связанных с заболеваниями, находятся именно в этих некодирующих регионах. До появления SDR-seq, существующие одноклеточные методы не обладали достаточной чувствительностью или масштабом для эффективного их изучения. Это ограничивало понимание того, как варианты ДНК влияют на активность генов и способствуют развитию патологий.
«В этой некодирующей области, – отмечает Линденхофер, – мы знаем о существовании вариантов, связанных, например, с врождёнными пороками сердца, аутизмом и шизофренией, которые остаются в значительной степени неизученными. И это далеко не полный список таких заболеваний. Нам был нужен инструмент для такого исследования, чтобы понять, какие варианты функциональны в их эндогенном геномном контексте, и как они способствуют прогрессированию болезни».
Для проведения одноклеточного секвенирования ДНК-РНК (SDR-seq) учёные использовали микроскопические капли масляно-водной эмульсии, каждая из которых содержала всего одну клетку. Это позволило одновременно анализировать ДНК и РНК, изучать тысячи клеток за один эксперимент и напрямую связывать генетические изменения с особенностями генной активности. Разработка этой сложной технологии стала результатом сотрудничества между отделами геномной биологии, структурной и вычислительной биологии EMBL, Медицинской школой Стэнфордского университета и Университетской клиникой Гейдельберга.
Специалисты из групп Джудит Заугг и Кён-Мин Но из EMBL разработали метод сохранения деликатной РНК путём «фиксации» клеток. В то же время, вычислительные биологи из группы Оливера Штегле создали специализированное программное обеспечение для расшифровки сложной системы ДНК-штрихкодирования, необходимой для анализа данных. Хотя это программное обеспечение было разработано специально для данного проекта, команда считает, что оно может быть полезно для множества других исследований.
Исследователи из групп Вольфганга Хубера и Саши Дитриха из EMBL и Университетской клиники Гейдельберга уже изучали образцы В-клеточной лимфомы для других проектов. Эти образцы пациентов, богатые генетическими вариациями, стали идеальной проверкой для новой технологии. Используя их, Линденхофер выявил связь между вариациями в ДНК и патологическими процессами, наблюдая, что раковые клетки с большим числом вариантов демонстрировали усиленные сигналы активации, способствующие росту опухоли.
«Мы используем эти крошечные реакционные камеры для считывания ДНК и РНК в одной и той же клетке, – объясняет Линденхофер. – Это позволяет нам точно определить, находится ли вариант на одной или обеих копиях гена, и измерить его влияние на экспрессию генов в тех же отдельных клетках. На примере клеток В-клеточной лимфомы мы смогли показать, что в зависимости от состава вариантов, клетки имели различную предрасположенность к определённым клеточным состояниям. Мы также заметили, что увеличение числа вариантов в клетке было связано с более злокачественным состоянием В-клеточной лимфомы».
Инструмент SDR-seq предоставляет биологам-геномистам новые возможности по масштабированию, точности и скорости анализа для лучшего понимания генетических вариантов. Хотя в конечном итоге технология может сыграть решающую роль в лечении широкого спектра сложных заболеваний, на первом этапе она, вероятно, поможет в разработке более совершенных диагностических скрининговых инструментов.
«Мы создали инструмент, способный связывать варианты с заболеваниями, – подчёркивает Ларс Штайнмец, старший автор статьи, руководитель группы EMBL и профессор генетики в Медицинской школе Стэнфордского университета. – Эта возможность открывает широкий спектр биологических исследований. Если мы сможем понять, как варианты регулируют болезнь и лучше осознать сам патологический процесс, у нас появятся гораздо лучшие шансы для вмешательства и лечения».
